三叶木通(Akebia trifoliate (Thunb.) Koidz)为木通科木通属木质藤本植物，原产于中国和日本，在我国主要分布于贵州、湖南、湖北、陕西和江西等地区(马玉华和王荔, 2011)。中药预知子为其干燥近成熟果实(国家药典委员会, 2015)。近年来，针对三叶木通的研究主要集中在对其化学成分、生态学、药理作用、扦插栽培以及指纹图谱等方面(吴永朋等, 2013)。文献报道，α-常春藤皂苷是其主要指标性成分和活性成分(侯雄军等, 2012)，其中的有效成分对癌细胞。

理想的内参基因应该是在不同处理、不同组织，甚至不同物种之间的表达量相同，但实际实验中这样的内参基因是不存在的(袁伟等, 2012)。任何一种内参基因的稳定表达都是相对的，在一定类型的细胞或实验因素作用下稳定表达的某内参基因在其他类型的细胞中或实验因素作用下可能是变化的(阙友雄等, 2009)。因此筛选特定物种在特定处理中稳定表达的内参基因是进行荧光定量试验的前提。

1结果与分析

1.1 RNA 检测

用1%琼脂糖凝胶电泳对所获得RNA 进行完整性验证，18S 与28S 电泳条带亮而5S条带暗，说明RNA 未降解，完整性良好(图1)。并利用Thermo Scientific酶标仪对RNA 进行浓度检测(表1)。

1.2初步评价

geNorm评价结果显示，在22 条候选内参基因中逐一删除M 值最大的基因，最终剩余的10 条候选内参基因分别为：RG3、RG5、RG7、RG9、RG12、RG14、RG15、RG17、RG19 和RG21 (表2)。Normfinder评价结果显示，在22 条候选内参基因中最稳定的前10 条基因分别是RG15、RG21、RG7、RG12、RG19、RG4、RG17、RG3、RG5 和RG9 (表3)。其中9条候选内参基因(RG3, RG5, RG7, RG9, RG12, RG15,RG17, RG19, RG21)在两种软件的评价结果中均显示较稳定。

1.3二次评价

受对初次评价筛选出的9 条候选内参基因利用geNorm、Normfinder 和BestKeeper 三个软进行二次评价(表4)。geNorm 软件评价显示在9 条候选内参基因中RG19 表达最稳定，RG17 表达最不稳定。按照M 值由小到大排序为：RG19

BestKeeper 软件评价也显示9 条候选内参基因中RG19 表达最稳定，RG17 表达最不稳定。根据SD值由小到大排序为：RG19(

1.4内参基因标准曲线及溶解曲线

无软件分析显示RG5 (EF-α)与RG19 (histone h3)配合使用作为内参基因最稳定。故对两条内参基因进行标准曲线验证，由仪器自带软件构建标准曲线(表5)。由荧光定量仪器自带软件生成RG5 (EF-α)与RG19 (histone h3)两条内参基因的溶解曲线，并计算出Tm 值分别为79.6℃ (图4)和83.2℃ (图5)，二者均表现出明显的单峰，说明两条基因特异性较好。

2讨论

使用本试验以野生三叶木通6个不同发育时期的果实作为样品，基于果实转录组数据获得候选内参基因的序列进行引物设计及实时荧光定量PCR 试验，用geNorm、Normfinder 和BestKeeper 三个软件对各候选内参基因稳定性进行分析。结果显示geNorm、Normfinder 和BestKeeper 三个软件评价结果基本一致，均认为本试验中的RG19 (histone h3)为各候选内参基因中最稳定的内参基因。geNorm软件默认为M值小于1.5的基因是稳定表达的基因，M 值越小表明基因表达越稳定。本试验中9条候选内参基因M值均小于0.3，其中RG19(histone h3)基因的M 值仅为0.22。在Bestkeeper 软件评价中，SD 值小于1 的内参基因被认为是稳定表达的基因，SD越小表明该基因越稳定(肖翠等, 2012)。本试验中的9 条候选内参基因SD 值均小于0.4，其中RG19 (histone h3)基因的SD 值仅为0.20。由上述软件评价可知，本试验中的9 条候选内参基因的稳定性均已达到作为内参基因的标准，其中筛选出的最优选择则更能满足荧光定量试验中对内参基因稳定性的要求。

geNorm 软件通过候选内参基因标准化因子(normalization factor)的配对差异(pairwise variation)分析(Vn/n+1)来判定所需内参基因的最适数目。默认值为Vn/n+1=0.15。若Vn/n+1<0.15 说明以n 个基因作为内参基因组合已经足够稳定，不需要引入第n+1条基因(符伟等, 2012)。本试验中n=2 时的Vn/n+1=0.060，明显小于默认值0.15，因此可以认为取2 条基因作为内参基因的稳定性已经非常可信，不需要引入第3条内参基因。

综上所述，本试验获得了三叶木通果实成熟过程中表达稳定的内参基因，并进行了标准曲线和溶解曲线验证。最终证实，以RG19 (histone h3)与RG5(EF-α)两条基因配合，可作为三叶木通果实成熟过程中的内参基因使用。本试验结果可为三叶木通果实成熟过程中的基因表达分析提供参考。

3材料与方法

3.1内参基因标准曲线及溶解曲线

无试验材料为野生三叶木通果实，取自贵州省贵阳市花溪区花溪乡麦乃寨，经贵州大学生命科学学院赵财副教授鉴定为木通科木通属三叶木通(Akebia trifoliate (Thunb.) Koidz)。采样时间为自2014 年4 月起每隔一个月采样一次，共采集6个时期的果实样品。果实采下后立即用液氮速冻，后转存于-80℃超低温冰箱中保存。

3.2 RNA 提取及浓度检测

无果实样品在冷冻的研钵中磨细，按照Plant RNAKit (200) R6827-02 (OMEGA 公司)试剂盒说明提取RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳对所获得RNA 进行完整性验证，利用Thermo Scientific 酶标仪对RNA进行浓度检测。用DEPC水将所有RNA 稀释至相同浓度用于下游实验(Remans et al., 2008)。

3.3 cDNA 合成

无按照反转录试剂盒PrimerScriptTM RT ReagentKit Perfect Real time (TaKaRa 公司)说明进行反转录。获得的cDNA 置于-20℃保存备用。

3.4候选内参基因筛选及引物设计

根据文献，共筛出18s RNA、actin、CYP、Cyt b、EF-α、elf、F-BOX、GAPDH、Histone h3、PP2A、rpl、SAND、EF、UBQ、APR、GBP、TUA 与TUB 共17 种类型的内参基因(Reid et al., 2006; Remans et al., 2008; 阙友雄等, 2009; 杨爱馥等, 2010; 袁伟等, 2012; 岳秀利等, 2013; 裴徐梨等, 2014; 张玉芳等, 2014)。从三叶木通果实转录组数据中搜索出以上17类内参基因共207 条，对转录组中的表达量数据进行分析，筛选出结果较稳定的基因22 条作为候选内参基因。用在线引物设计软件(http://www. idtdna.com/primerquest/Home/Index)对22 条候选内参基因进行引物设计，引物序列(表6)送至英俊生物公司进行合成

3.5实时荧光定量PCR

无以cDNA 为模板，对22 条候选内参基因进行荧光定量PCR。试验体系为20 L：10 μL 荧光染料SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara 公司, SYBR ® PremixEx Taq^TMⅡTli RNaseH Plus)，10 mol/L的上下游引物各1 μL，cDNA模版1 μL，7 μL超纯水。反应在qTOWER 2.2实时荧光定量PCR 仪中(analytikjena公司)进行。试验条件采用两步法：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火与延伸30 s，进行35个循环，60~95℃每0.6℃进行1 次荧光监测测定熔解曲线。每个样品设三个重复。

3.6数据分析

无由qTOWER 2.2实时荧光定量PCR 仪自带的软件计算三个重复的Ct 平均值为该基因在该样品中的Ct 值。用geNorm、Normfinder和BestKeeper三个软件对各候选内参基因稳定性进行分析。geNorm软件根据相对定量数据q值计算出每个候选内参基因的稳定性值(M value)，然后计算某一内参基因与其他内参基因的配对变异系数(Vn/n+1)从而判定所需内参基因的最适数目。Normfinder 软件同样根据相对定量数据q值进行分析，结合组内方差与组间方差，计算出稳定值(stability value)，根据稳定值的大小对内参基因的稳定性进行评价(周良云等, 2014)。BestKeeper软件直接对Ct 值进行分析，主要以标准变异系数(SD)和变异相关系数(CV)来判断内参基因的稳定性(侯维海等, 2011)。由于BestKeeper 软件一次最多只能同时对10条内参基因进行评价。

因此本试验先用geNorm 和Normfinder 两软件对22条候选内参基因进行初步评价，筛选出两软件均认为最为稳定的前10 条候选内参基因，再使用geNorm、Normfinder 和BestKeeper 三软进行二次评价。

3.7内参基因标准曲线

评价出最稳定的内参基因进行标准曲线的验证。采用上述荧光定量PCR 体系及条件，将样品cDNA 按5 倍梯度稀释(共5个稀释浓度)，每个浓度设3个重复，仪器自带软件构建标准曲线。

使用本试验以野生三叶木通6 个不同发育时期的果实作为样品，基于果实转录组数据获得候选内参基因的序列进行引物设计及实时荧光定量PCR 试验，用geNorm、Normfinder 和BestKeeper 三个软件对各候选内参基因稳定性进行分析。结果显示geNorm、Normfinder 和BestKeeper三个软件评价结果基本一致，均认为本试验中的RG19 (histone h3)为各候选内参基因中最稳定的内参基因。geNorm 软件默认为M值小于1.5的基因是稳定表达的基因，M 值越小表明基因表达越稳定。

作者贡献

杨航是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成数据分析及论文初稿写作；刘红昌和罗辉参与实验设计、实验结果分析；葛菲和石小兵参与试验材料收集与管理；赵致是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

诚挚本研究由贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目《木通仿生栽培研究与应用示范》(黔科合SY 字[2014] 3034-1 号)、贵州省林业厅青年人才基金项目(黔林科合J 字[2014] 08 号)和贵州省药用植物繁育与种植人才基地(黔人领发(2013) 15 号)共同资助。

参考文献

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